一、光學(xué)顯微鏡

光學(xué)顯微鏡是一種精密的光學(xué)儀器。當(dāng)前使用的顯微鏡由一套透鏡配合，因而可選擇不同的放大倍數(shù)對(duì)物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)進(jìn)行放大觀察。普通光學(xué)顯微鏡通常能將物體放大 1500～2000 倍(zui大的分辨力為 0.2μm)。

（一）光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)（附圖1）

1．光學(xué)部分 包括目鏡、物鏡、聚光器和光源等。

（1）目鏡 通常由兩組透鏡組成，上端的一組又稱為“接目鏡”，下端的則稱為“場(chǎng)鏡”。兩者之間或在場(chǎng)鏡的下方裝有視場(chǎng)光闌（金屬環(huán)狀裝置），經(jīng)物鏡放大后的中間像就落在視場(chǎng)光闌平面上，所以其上可加置目鏡測(cè)微尺。在目鏡上方刻有放大倍數(shù)，如 10×、20×等。按照視場(chǎng)的大小，目鏡可分為普通目鏡和廣角目鏡。有些顯微鏡的目鏡上還附有視度調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)，操作者可以對(duì)左右眼分別進(jìn)行視度調(diào)整。另有照相目鏡(NFK)可用于拍攝。

（2）物鏡 由數(shù)組透鏡組成，安裝于轉(zhuǎn)換器上，又稱接物鏡。通常每臺(tái)顯微鏡配備一套不同倍數(shù)的物鏡，包括：①低倍物鏡：指 1×～6×；
            ②中倍物鏡：指 6×～25×；
            ③高倍物鏡：指 25×～63×；④油浸物鏡：指 90×～100×。
     其中油浸物鏡使用時(shí)需在物鏡的下表面和蓋玻片的上表面之間填充折射率為 1.5 左右的液體（如香柏油等），它能顯著地提高顯微觀察的分辨率。其他物鏡則直接使用。觀察過(guò)程中物鏡的選擇一般遵循由低到高的順序，因?yàn)榈捅剁R的視野大，便于查找待檢的具體部位。顯微鏡的放大倍數(shù)，可粗略視為目鏡放大倍數(shù)與物鏡放大倍數(shù)的乘積。

（3）聚光器 由聚光透鏡和虹彩光圈組成，位于在載物臺(tái)下方。聚光透鏡的功能是將光線聚焦于視場(chǎng)范圍內(nèi)；透鏡組下方的虹彩光圈可開(kāi)大縮小，以控制聚光器的通光范圍，調(diào)節(jié)光的強(qiáng)度，影響成像的分辨力和反差。使用時(shí)應(yīng)根據(jù)觀察目的，配合光源強(qiáng)度加以調(diào)節(jié)，得到*成像效果。

（4）光源 較早的普通光學(xué)顯微鏡借助鏡座上的反光鏡，將自然光或燈光反射到聚光器透鏡的中央作為鏡檢光源。反光鏡是由一平面和另一凹面的鏡子組成。不用聚光器或光線較強(qiáng)時(shí)用凹面鏡，凹面鏡能起會(huì)聚光線的作用；用聚光器或光較弱時(shí)，一般都用平面鏡。新近出產(chǎn)的顯微鏡一般直接在鏡座上安裝光源，并有電流調(diào)節(jié)螺旋，用于調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度。光源類型有鹵素?zé)簟㈡u絲燈、汞燈、熒光燈、金屬鹵化物燈等。

        顯微鏡的光源照明方法分為兩種：透射型與反射(落射)型。前者是指光源由下而上通過(guò)透明的鏡檢對(duì)象；反射型顯微鏡則是以物鏡上方打光到(落射照明)不透明的物體上。

2. 機(jī)械部分 包括鏡座、鏡柱、鏡壁、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)和準(zhǔn)焦螺旋等。
（1）鏡座 基座部分，用于支持整臺(tái)顯微鏡的平穩(wěn)。
（2）鏡柱 鏡座與鏡臂之間的直立短柱，起連接和支持的作用。
（3）鏡臂 顯微鏡后方的弓形部分，是移動(dòng)顯微鏡時(shí)握持的部位。有的顯微鏡在鏡臂與鏡柱之間有一活動(dòng)的傾斜關(guān)節(jié)，可調(diào)節(jié)鏡筒向后傾斜的角度，便于觀察。
（4）鏡筒 安裝在鏡臂先端的圓筒狀結(jié)構(gòu)，上連目鏡，下連接物鏡轉(zhuǎn)換器。顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)筒長(zhǎng)為 160 mm，此數(shù)字標(biāo)在物鏡的外殼上。
（5）物鏡轉(zhuǎn)換器 鏡筒下端的可自由旋轉(zhuǎn)的圓盤，用于安裝物鏡。觀察時(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器來(lái)調(diào)換不同倍數(shù)的物鏡。
（6）載物臺(tái) 鏡筒下方的平臺(tái)，中央有一圓形的通光孔。用于放置載玻片。載物臺(tái)上裝有固定標(biāo)本的彈簧夾，一側(cè)有推進(jìn)器，可移動(dòng)標(biāo)本的位置。有些推動(dòng)器上還附有刻度，可直接計(jì)算標(biāo)本移動(dòng)的距離以及確定標(biāo)本的位置。
（7）準(zhǔn)焦螺旋 裝在鏡臂或鏡柱上的大小兩種螺旋，轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)可使鏡筒或載物臺(tái)上下移動(dòng)，從而調(diào)節(jié)成像系統(tǒng)的焦距。大的稱為粗準(zhǔn)焦螺旋，每轉(zhuǎn)動(dòng)一圈，鏡筒升降 10mm；小的為細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，轉(zhuǎn)動(dòng)一圈可使鏡筒僅升降 0.1mm。一般在低倍鏡下觀察物體時(shí)，以粗準(zhǔn)焦螺旋迅速調(diào)節(jié)物像，使之位于視野中。在此基礎(chǔ)上，或在使用高倍鏡時(shí)，用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋微調(diào)。必須注意，一般顯微鏡裝有左右兩套準(zhǔn)焦螺旋，作用相同，但切勿兩手同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)兩側(cè)的螺旋，防止因雙手力量不均產(chǎn)生扭力，導(dǎo)致螺旋滑絲。

（二）普通光學(xué)顯微鏡的基本成像原理

光線→（反光鏡）→遮光器→通光孔→鏡檢樣品（透明）→物鏡的透鏡（*次放大成倒立實(shí)像）→鏡筒→目鏡（再次放大成虛像）→眼。

（三）普通光學(xué)顯微鏡的使用過(guò)程

1．鏡檢前的準(zhǔn)備 室內(nèi)應(yīng)清潔而干燥，實(shí)驗(yàn)臺(tái)臺(tái)面水平，穩(wěn)固無(wú)震動(dòng)，顯微鏡附近不應(yīng)放置腐蝕性的試劑。從顯微鏡柜或鏡箱內(nèi)取出顯微鏡時(shí)，要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩(wěn)地取出，放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)桌面上，置于操作者左前方，距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊緣約10cm，鏡臂朝自己，鏡筒朝前。實(shí)驗(yàn)臺(tái)右側(cè)放繪圖用具。

2．調(diào)節(jié)光源 如需利用外置光源，宜采用散射的自然光或柔和的燈光。直射的太陽(yáng)光會(huì)對(duì)觀察者的眼睛造成傷害。轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡正對(duì)通光孔，將聚光器上的虹彩光圈開(kāi)到zui大，觀察目鏡中視野亮度，同時(shí)調(diào)節(jié)反光鏡角度，使光照達(dá)到zui明亮zui均勻。自帶光源的顯微鏡，可通過(guò)調(diào)節(jié)電流旋鈕來(lái)調(diào)節(jié)光照的強(qiáng)弱。

3．裝置待檢玻片 將待觀察的樣品制作成臨時(shí)或*裝片，放在載物臺(tái)上，用彈簧夾固定，有蓋玻片的一面朝上。移動(dòng)推進(jìn)器，調(diào)節(jié)待檢樣品至通光孔的中心。

4．低倍鏡觀察 將低倍鏡對(duì)準(zhǔn)通光孔，緩緩轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，將物鏡與裝片的距離調(diào)至zui近。注意不要壓碎蓋玻片。通過(guò)目鏡觀察，同時(shí)用粗準(zhǔn)焦螺旋緩慢調(diào)節(jié)，直至物像出現(xiàn)，再用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋微調(diào)，同時(shí)調(diào)節(jié)光源亮度與虹彩光圈的大小，使物像達(dá)到zui清晰的程度。并利用推進(jìn)器把需要進(jìn)一步放大觀察的部分移至視野中央。如果使用雙筒目鏡，應(yīng)在觀察前先調(diào)整雙筒距離，使兩眼視場(chǎng)合并。

5．高 倍鏡觀察 轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，選 擇較高倍數(shù)的物鏡，用 細(xì)準(zhǔn)焦螺旋調(diào)節(jié)焦距，到 物像清晰為止。

6．油鏡觀察 油浸物鏡的工作距離（指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離）很短，一般在 0.2 mm 以內(nèi)，且一般光學(xué)顯微鏡的油浸物鏡沒(méi)有“彈簧裝置”，因此使用油浸物鏡時(shí)，調(diào)焦速度必須放慢，避免壓碎玻片，并使物鏡受損。
（1）在低倍鏡下找到觀察目標(biāo)，中、高倍鏡下逐步放大，將待觀察部位置于視野中央，調(diào)節(jié)光源和虹彩光圈，使通過(guò)聚光器的光亮達(dá)到zui大。
（2）轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，將鏡筒上旋（或?qū)⑤d物臺(tái)下降）約 2 cm，加一小滴香柏油于玻片的鏡檢部位上。
（3）將 粗準(zhǔn)焦螺旋緩緩轉(zhuǎn)回，同 時(shí)注意從側(cè)面觀察，直 至油鏡浸入油滴，鏡 頭幾乎與標(biāo)本接觸。
（4）從目鏡中觀察，用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋微調(diào)，直至物象清晰。
（5）鏡檢結(jié)束后，將鏡頭旋離玻片，立即清潔鏡頭。一般先用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油滴。再用擦鏡紙蘸少許(C2H5)20酒精混合液（2：3），擦去殘留油跡，zui后再用干凈的擦鏡紙擦凈（注意向一個(gè)方向擦拭）。

7．還原顯微鏡 關(guān)閉內(nèi)置光源并拔下電源插頭，或使反光鏡與聚光器垂直。旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡頭呈八字形位置與通光孔相對(duì)。再將鏡筒與載物臺(tái)距離調(diào)至zui近，降下聚光器。罩上防塵罩，將顯微鏡放回柜內(nèi)或鏡箱中。

二、幾種特殊的光學(xué)顯微鏡

（一）暗視野顯微鏡

        暗視野顯微鏡不具備觀察物體內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)的功能，但可以分辨 0.004μm 以上的微粒的存在和運(yùn)動(dòng)。因而常用于觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)微粒的運(yùn)動(dòng)等。暗視野顯微鏡的基本原理是丁達(dá)爾效應(yīng)。當(dāng)一束光線透過(guò)黑暗的房間，從垂直于入射光的方向可以觀察到空氣里出現(xiàn)的一條光亮的灰塵“通路”，這種現(xiàn)象即丁達(dá)爾效應(yīng)。暗視野顯微鏡在普通的光學(xué)顯微鏡上換裝暗視野聚光鏡后，由于該聚光器內(nèi)部拋物面結(jié)構(gòu)的遮擋，照射在待檢物體表面的光線不能直接進(jìn)入物鏡和目鏡，僅散射光能通過(guò)，因而視野是黑暗的。操作者通過(guò)目鏡觀察到的，是檢物體的衍射光圖像（附圖12）。

暗視野顯微鏡的基本使用方法如下：

1．安裝暗視野聚光器（或用厚實(shí)的黑紙片制成遮光板，放在普通顯微鏡的聚光器下方，也能得到暗視野效果）。
2．選用強(qiáng)光源，一般用顯微鏡燈照明，以防止直射光線進(jìn)入物鏡。
3．在聚光器和玻片之間加一滴香柏油，避免照明光線于聚光鏡上進(jìn)行全反射，達(dá)不到被檢物體，而得不到暗視野照明。
4．進(jìn)行中心調(diào)節(jié)，即水平移動(dòng)聚光器，使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴(yán)格位于一直線上。升降聚光器，將聚光鏡的焦點(diǎn)（圖 2 中圓錐光束的頂點(diǎn)）對(duì)準(zhǔn)待檢物。
5．選用與聚光器相應(yīng)的物鏡，調(diào)節(jié)焦距，按普通顯微鏡的方法操作。

（二）體視顯微鏡

體視顯微鏡又稱實(shí)體顯微鏡或解剖鏡，其成像為正立三維的空間影像，并具有立體感強(qiáng)、成像清晰寬闊、長(zhǎng)工作距離（通常為 110 mm）以及連續(xù)放大觀看等特點(diǎn)。生物學(xué)上常用于解剖過(guò)程中的實(shí)時(shí)觀察（附圖 13）。

普通光學(xué)顯微鏡的光源為平行光，因而形成的是二維平面影像；而體視顯微鏡采用雙通道光路，雙目鏡筒中的左右兩光束具有一定的夾角體視角（一般為 12o15o），因而能形成三維空間的立體圖像。體視顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的使用方法相近，但更為便捷。二者的主要區(qū)別在于：

1. 體視顯微鏡的鏡檢對(duì)象可不必制作成裝片。
2. 體視顯微鏡載物臺(tái)直接固定在鏡座上，并配有黑白雙面板或玻璃板，操作者可根據(jù)鏡檢的對(duì)象和要求加以選擇。
3. 體視顯微鏡的成像是正立的，便于解剖操作。
4. 體視顯微鏡的物鏡僅一只，其放大倍數(shù)可通過(guò)旋轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)螺旋連續(xù)調(diào)節(jié)。

（三） 熒光顯微鏡

熒光顯微鏡是利用細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)射的熒光強(qiáng)度對(duì)其進(jìn)行定性和定量研究的一種光學(xué)工具。細(xì)胞內(nèi)的熒光物質(zhì)物質(zhì)有兩類，一類直接經(jīng)紫外線照射后即可發(fā)熒光，如葉綠素等；另有一些物質(zhì)本身不具這一性質(zhì)，但如果以特定的熒光染料或熒光抗體染色，經(jīng)紫外線照射后亦可發(fā)熒光（附圖 1-4）。

熒光顯微鏡的原理為利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源（如超高壓汞燈），經(jīng) 過(guò)濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長(zhǎng)的光(如紫外光3650λ 或紫藍(lán)光4200λ)作為激發(fā)光，激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各色的熒光后，再通過(guò)物鏡后面的阻斷(或壓制)濾光片的過(guò)濾，zui后經(jīng)由目鏡的放大作用加以觀察。阻斷濾光片的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡以免干擾熒光和損傷眼睛；二是選擇并讓特定的熒光透過(guò)，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。

熒光顯微鏡按照光路原理可分為兩種：

1．透射式熒光顯微鏡 較為舊式的熒光顯微鏡，其激發(fā)光源通過(guò)聚光鏡穿過(guò)標(biāo)本材料來(lái)激發(fā)熒光。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強(qiáng)，而缺點(diǎn)是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱。所以它僅適用于觀察較大的標(biāo)本材料。
2．落射式熒光顯微鏡 激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡(附圖 1-5)。

光路中需加上一個(gè)雙色束分離器（分色鏡），它與光軸呈 45o 角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡，返回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開(kāi)，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強(qiáng)。

（四）相差顯微鏡

          相差顯微鏡是能將光通過(guò)物體時(shí)產(chǎn)生的相位差（或光程差）轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹ü鈴?qiáng)度）變化的顯微鏡。主要用于觀察活細(xì)胞、不染色的組織切片或缺少反差的染色標(biāo)本。人眼只能鑒別可見(jiàn)光的波長(zhǎng)（顏色）和振幅的變化，不能鑒別相位的變化。而大多數(shù)生物標(biāo)本高度透明，光波通過(guò)后振幅基本不變，僅存在相位的變化。相差顯微鏡基本把透過(guò)標(biāo)本的可見(jiàn)光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見(jiàn)。光線透過(guò)標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來(lái)的光路，同時(shí)被延遲了 1/4λ（波長(zhǎng)），如果再增加或減少 1/4λ，則光程差變?yōu)?nbsp;1/2λ，兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減下，提高反差（見(jiàn)圖 6）。

從結(jié)構(gòu)上看，相差顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡不同之處在于：

1．環(huán)形光闌具有環(huán)形開(kāi)孔的光闌，安裝在光源與聚光器之間，作用是使透過(guò)聚光器的光線形成空心光錐，聚焦到標(biāo)本上。
2．相位板相差顯微鏡在物鏡內(nèi)部增加了涂有氟化鎂的相位板，作用是將直射光或衍射光的相位推遲 1/4λ。相板上有兩個(gè)區(qū)域，直射光通過(guò)的部分叫“共軛面”，衍射光通過(guò)的部分叫“補(bǔ)償面”。相位板按工作效果分為兩種類型：

（1）A+相板：將直射光推遲 1/4λ，兩組光波合軸后光波疊加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加明亮，形成亮反差（或稱負(fù)反差）。
（2）B+相板：將衍射光推遲 1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加暗淡，形成暗反差（或稱正反差）。帶有相板的物鏡叫相差物鏡，常在物鏡外殼上標(biāo)以“Ph”字樣。

3．合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡

        相差顯微鏡配備有一個(gè)合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡（在外殼上標(biāo)有“CT”符號(hào)），用于調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌的像與相板共軛面*吻合，以便實(shí)現(xiàn)對(duì)直射光和衍射光的特殊處理。使用時(shí)撥去一側(cè)目鏡，插入合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，調(diào)節(jié)合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡的焦點(diǎn)，視野中會(huì)呈現(xiàn)兩個(gè)圓環(huán)，分別是明亮的環(huán)狀光闌圓環(huán)與較暗的相板上共軛面圓環(huán)。再轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器上的環(huán)狀光闌的兩個(gè)調(diào)節(jié)螺旋，使兩環(huán)*重疊。如明亮的光環(huán)過(guò)小或過(guò)大，可調(diào)節(jié)聚光器的升降旋鈕，使兩環(huán)*吻合。如果聚光器已升到zui高點(diǎn)或降到zui低點(diǎn)而仍不能矯正，說(shuō)明玻片太厚了，應(yīng)更換。調(diào)好后即可取下合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，換回目鏡。

4．綠色濾光片

        用于調(diào)整光源的波長(zhǎng)。照明光線的波長(zhǎng)不同，會(huì)引起相位的變化，為了獲得良好的相差效果，相差顯微鏡要求使用波長(zhǎng)范圍比較窄的單色光，通常是用綠色濾光片來(lái)調(diào)整。相差顯微鏡的使用步驟如下：

① 根據(jù)待檢標(biāo)本的性質(zhì)及要求，挑選適合的相差物鏡。
② 將標(biāo)本玻片放到載物臺(tái)上，進(jìn)行光軸中心的調(diào)整。
③ 使用合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，調(diào) 整環(huán)狀光闌與相板上的共軛面圓環(huán)*重疊吻合后，換回目鏡。在觀察過(guò)程中，每次更換物鏡倍數(shù)時(shí)，必須重新進(jìn)行環(huán)狀光闌與相板共軛面圓環(huán)吻合的調(diào)整。
④ 加綠色濾光片，按普通光學(xué)顯微鏡的操作步驟進(jìn)行觀察。

（五）倒置顯微鏡

        倒置顯微鏡的結(jié)構(gòu)和普通顯微鏡基本相同，只不過(guò)物鏡與照明系統(tǒng)位置交換，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上。主要用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，需配制相差物鏡。

（六）偏光顯微鏡

偏光顯微鏡可用于檢測(cè)具有雙折射性的物質(zhì)，如染色體、膠原、纖維絲等（附圖 1-7）

和普通顯微鏡不同的是：

① 偏光顯微鏡光源前配備偏振鏡（起偏器），使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光。
② 鏡筒中有檢偏振鏡（檢偏器，一個(gè)偏振方向與起偏器垂直的的起偏器）。
③ 使用旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)。當(dāng)載物臺(tái)上放入單折射的物質(zhì)時(shí)，無(wú)論如何旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)，由于兩個(gè)偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線，而放入雙折射性物質(zhì)時(shí)，由于光線通過(guò)這類物質(zhì)時(shí)發(fā)生偏轉(zhuǎn)，因此旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)便能檢測(cè)到這種物體。
④ 配備補(bǔ)償器或相位片；
⑤ 使用無(wú)應(yīng)力物鏡。

三、電子顯微鏡

電子顯微鏡是利用高速運(yùn)動(dòng)的電子束來(lái)代替光波的一種顯微鏡。光學(xué)顯微鏡下只能清楚地觀察大于 0.2 μm 的結(jié)構(gòu)。而小于 0.2 μm 的結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopic structures）或超微結(jié)構(gòu)（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。要想看清這些更為細(xì)微的結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長(zhǎng)更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。電子束的波長(zhǎng)要比可見(jiàn)光和紫外光短得多，并且電子束的波長(zhǎng)與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說(shuō)電壓越高波長(zhǎng)越短。因此電子顯微鏡的分辨率遠(yuǎn)高于光學(xué)顯微鏡，目前可達(dá) 0.2 nm，放大倍數(shù)可達(dá) 80 萬(wàn)倍。電子顯微鏡的基本要結(jié)構(gòu)包括鏡筒、真空系統(tǒng)和電源柜三部分。鏡筒主要由電子槍、電子透鏡、樣品架、熒光屏和照相機(jī)構(gòu)等部件，自上而下地裝配成一個(gè)柱體；真空系統(tǒng)包括機(jī)械真空泵、擴(kuò)散泵和真空閥門三部分，并通過(guò)抽氣管道與鏡筒相聯(lián)接；電源柜由高壓發(fā)生器、勵(lì)磁電流穩(wěn)流器和各種調(diào)節(jié)控制單元組成。電子透鏡是電子顯微鏡鏡筒中的關(guān)鍵部件。現(xiàn)代電子顯微鏡大多采用電磁透鏡，由穩(wěn)定的直流勵(lì)磁電流通過(guò)帶極靴的線圈產(chǎn)生的強(qiáng)磁場(chǎng)使電子聚焦。電子槍的作用是發(fā)射并形成速度均勻的電子束，由燈絲（陰極）、柵極和陽(yáng)極（加速極）構(gòu)成。陰極管發(fā)射的電子通過(guò)柵極上的小孔形成射線束，經(jīng)陽(yáng)極電壓加速后射向聚光鏡，起到對(duì)電子束加速、加壓的作用。使用中加速電壓的穩(wěn)定度要求不低于萬(wàn)分之一。電子顯微鏡按結(jié)構(gòu)和用途可分為透射式電子顯微鏡、掃描式電子顯微鏡、反射式電子顯微鏡和發(fā)射式電子顯微鏡等。其中生物學(xué)研究中使用的是透射式和掃描式電子顯微鏡。前者常用于觀察那些用普通顯微鏡所不能分辨的細(xì)微物質(zhì)結(jié)構(gòu)；后者主要用于觀察固體表面的形貌。

（一）透射式電子顯微鏡

透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）的組件包括：

1. 電子槍 發(fā)射電子，由陰極、柵極、陽(yáng)極組成。
2. 聚光透鏡 即電子透鏡，將電子束聚集，可用于控制照明強(qiáng)度和孔徑角。
3. 樣品室 放置待觀察的樣品，并裝有旋轉(zhuǎn)臺(tái)，用以改變?cè)嚇拥慕嵌龋€有裝配加熱、冷卻等設(shè)備。
4. 物鏡 為放大率很高的短距透鏡，作用是放大電子像。物鏡是決定透射電子顯微鏡分辨能力和成像質(zhì)量的關(guān)鍵。
5. 中間鏡 為可變倍的弱透鏡，作用是對(duì)電子像進(jìn)行二次放大。通過(guò)調(diào)節(jié)中間鏡的電流，可選擇物體的像或電子衍射圖來(lái)進(jìn)行放大。
6. 透射鏡 為高倍的強(qiáng)透鏡，用將二次放大后的中間像進(jìn)一步放大后在熒光屏上成像。
7. 二級(jí)真空泵 對(duì)樣品室抽真空。
8．照相裝置 用以記錄影像。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，樣品的密度、厚度等都會(huì)影響到zui后的成像質(zhì)量，必須制備更薄的超薄切片，通常為 50～100 nm。所以用透射電子顯微鏡觀察時(shí)的樣品需要處理得很薄。通常用薄切片法或冷凍蝕刻法制備：

（1）薄切片法 通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環(huán)氧樹(shù)脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式推進(jìn)樣品切片，切片厚度 20～50 nm，采用重金屬鹽染色，以增大反差。
（2）冷凍蝕刻法 亦稱冰凍斷裂法。將標(biāo)本置于100?C 的干冰或196?C 的液氮中冰凍后，以冷刀急速斷開(kāi)標(biāo)本。斷裂的標(biāo)本升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面結(jié)構(gòu)，稱為蝕刻。蝕刻完成后，向斷面以 45o 角噴涂一層蒸氣鉑，再以90o 角噴涂一層碳，加強(qiáng)反差和強(qiáng)度。然后用次氯酸鈉溶液消化樣品，剝下碳和鉑的膜，稱為復(fù)膜，能顯示標(biāo)本蝕刻面的形態(tài)。在電鏡下觀察得到的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞斷裂面處的結(jié)構(gòu)。

（二）掃描式電子顯微鏡

          掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）于 20 世紀(jì) 60 年代問(wèn)世，目前分辨力可達(dá) 6～10 nm。其工作原理是由電子槍發(fā)射的精細(xì)聚焦電子束經(jīng)兩級(jí)聚光鏡、偏轉(zhuǎn)線圈和物鏡射到樣品上，掃描樣品表面并激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的產(chǎn)生量與電子束入射角有關(guān)，即與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)。次級(jí)電子經(jīng)探測(cè)體收集后，由閃爍器轉(zhuǎn)換為光信號(hào)，再經(jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)來(lái)控制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。掃描電鏡的標(biāo)本在檢驗(yàn)前，需進(jìn)行固定、脫水處理，再噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。